氨基酸是動物的生長發(fā)育及動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的正常代謝所必須的重要組分，因此是評價飼料營養(yǎng)成分的一類重要指標，準確檢測氨基酸的含量和種類對于飼料質(zhì)量評價和控制具有重要意義。本文采用柱前衍生法，可同時對飼料中的17種氨基酸進行分析測定。

一、實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC1620A高效液相色譜儀（含UV檢測器1臺，P1620A高壓恒流泵2臺，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）

FA2004電子分析天平

恒溫箱

水解管（5型）

旋渦混勻器

氫氧火焰機

乙腈(色譜純，沃凱)

氨基酸標準品溶液（上海月旭）

超純水

2，4-二硝基氟苯（DNFB）、N,N-二甲基酰胺、濃鹽酸、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、冰醋酸（均為分析純）。

1.2 標準品溶液配制

1）氨基酸標準品溶液：氨基酸標準品溶液用水稀釋10倍到所需濃度（見表1）。

2）衍生化緩沖液的配制：稱取21g的NaHCO₃于1L燒杯中，加水470mL，搖勻、溶解。過濾至500mL試劑瓶中，再加乙腈30mL，搖勻即得。

3）衍生化試劑：取1mL DNFB加入100mL定量瓶中，乙腈定容至刻度即得。

4）平衡溶液的配制 ：取KH₂PO₄ 3.4g，加0.1mol/L的NaOH溶液145.5mL，加水至500mL，搖勻，過濾，貯存置棕色瓶中即得。

5）6mol/L鹽酸：取濃鹽酸500mL加入1L燒杯中，再加水500mL，搖勻即得。

1 十七種氨基酸濃度表

1.3 色譜條件：

色譜柱：Welch unitary Amino acid柱（4.6×250mm，5um）

流動相：A：40mM乙酸鈉緩沖液（冰醋酸調(diào)pH調(diào)至6.5）（含10mM N,N-二甲基酰胺）B：乙腈：水=1：1，梯度洗脫（見表2）

流速：1.2mL/min

柱溫：28℃

波長：360nm

進樣量：10ul

表2 梯度程序表

1.4 樣品前處理（氨基酸衍生化方法）

1. 精確稱取研磨成細粉的樣本粉末200mg置于水解管中，加入6mol/L的鹽酸12mL，輕微震蕩。用氫氧火焰機融化水解管頸部*密封。
2. 放于烘箱中145℃水解4小時，冷卻至室溫；
3. 小心敲碎水解管頂部；把水解液及殘渣用漏斗和濾紙過濾，濾至50mL容量瓶中；再用水洗滌水解管，每次洗滌水均再次洗滌濾紙，反復6-7次，然后加水定容至容量瓶刻度；
4. 用微量注射器取10ul定量好的溶液至1mL玻璃細管中，真空抽干（去HCl），然后依次加入衍生化緩沖液和衍生化試劑各20ul，渦旋30s，用多層密封帶封口；
5. 置烘箱中64℃衍生化30min，冷卻至室溫；
6. 加平衡緩沖液160ul，混勻30s，經(jīng)0.45um濾膜過濾，作為待測樣品溶液。

實驗結果請參見文檔